Геймплей в Resident Evil 5 схож с геимплейем из предыдущей нумерованной части Resident Evil 4.

Камера жёстко закреплена за плечом главного героя (Если выбран режим прохождения за Шеву Аломар то камера расположена с левой стороны, если за Криса Рэдфилда то с правой), кроме моментов когда персонаж игры управляет стационарным оружием и во время экшен-сцен. Игрок не может одновременно передвигаться и стрелять. При переходе в режим прицеливания игрок останавливается на месте. Перезарядка оружия и использование лечебных спрейев и трав может происходить как во время самого игрового процесса так и быть задействована из меню инвентаря. Инвентарь в Resident Evil 5 разделёна на две части. В одной экипировка самого игрока, а вторая часть содержит экипировку напарника. Предметы можно передавать от одного персонажа другому непосредственно во время игры. В Resident Evil 5 игровой процесс построен таким образом что часто игроку и его напарнику необходимо взаимодействие. Решение некоторых задач построено на взаимодействии (Например для открытия некоторых дверей игроку необходимо подсадить напарника или одновременно с ним нажимать на кнопки на разных пультах).

Также в Resident Evil 5 есть кооперативный режим сетевой режим и Split-Screen режим, который доступен только на консолях. Во время одиночного прохождения напарником управляет искусственный интеллект.

Сюжет игры разворачивается в вымышленном автономном районе Западной Африки — Кижуджу (англ. Kijuju). После событий, описанных в предыдущих играх серии, корпорация Umbrella исчезла, но ситуация с биологическим оружием не изменилась в лучшую сторону. Для противодействия био-угрозе была созданна специальная команда, названная BSAA (Bioterrorism Security Assessment Alliance). Команда была основана из людей, повидавших ужасы Раккун Сити (англ. Raccoon City), а также лучших из лучших агентов, таких как Шева Аломар.
Корпорация Tricell, основанная на руинах Амбреллы Альбертом Вескером, является одним из крупнейших транснациональных консорциумов на рынке фармацевтических продуктов. Но это лишь прикрытие настоящей деятельности корпорации — разработки и производства биоорганического оружия.
Альберт Вескер получил образцы микроорганизмов Лас-Плагас (англ. Las Plagas), на основе которых строится сюжет Resident Evil 4, и объеденив их с ранней разработкой корпорации Амбрелла — вирусом «Прародитель», создал новейший вирус «Уроборос» (англ. Uroboros). С его помощью, Вескер хочет уничтожить человечество, превратив людей в послушных рабов. Наша задача — помешать ему в этом.

* Крис Рэдфилд (Chris Redfield)(Владимир Вихров) — Крис уже засветился в оригинальной Resident Evil, где за него можно было поиграть. Крис входил в команду S.T.A.R.S., группы Альфа, которая была отправлена на поиски группы Браво. Крис исследует особняк Спенсера и узнает правду о Вескере, бывшем члене S.T.A.R.S., который предал их, чтобы испытать возможности мутировавших монстров. Но Крис и Джилл спасаются. Крис возвращается в Resident Evil: Code Veronica, пытаясь спасти свою сестру, Клер Редфилд, которая пыталась уничтожить тяжело укреплённую базу Umbrella на острове Рокфорт и была схвачена. Крис планирует вырвать сестру из рук Альберта Вескера и, наконец, встретиться лицом к лицу с предателем, но бой прерывает взрыв. Оба спасаются, но Крис не может простить Вескеру предательство и жаждет уничтожить его и его нанимателей, корпорацию Umbrella! Прошло 10 лет после инцидента в Раккун Сити. Крис вступает в BSAA, команду, борющуюся с биотеррористическими угрозами. Его новая миссия заносит его и его напарницу Шеву Аломар в район Киджуджу в Африке, где они обнаруживают, что жители заражены таинственной болезнью. Resident Evil 5 обещает рассказать, что произошло с остальными членами S.T.A.R.S., если учесть что прошло уже много времени.

* Шева Аломар (Sheva Alomar) — напарница Криса. Является членом BSAA в Западной Африке. Судьба Шевы трагична и полна загадок. Родители Шевы погибают на одной из фабрик Амбреллы при испытании биологического оружия сразу после этого Амбрелла уничтожают деревню в которой жила Шева .Потом Шева жила у дальних родственников, переезд сначала в США, а затем в Европу… Всё это негативно влияет на Шеву. Понимая, что в гибели родителей как-то замешана TriCell, Шева вступает в команду. Есть несколько отличий между Крисом и Шевой. Шева более подвижна и использует своё преимущество на поле боя. К тому же она левша и способна добраться до тех мест, куда Крис не может.

* Рикардо Ирвин (Ricardo Irving) — агент TriCell, который продавал биологическое оружие террористам. Имеет большую страсть к деньгам. Преследуем главными героями до середины игры, когда вкалывает себе вирус и мутирует, но Крис и Шева его побеждают.

* Альберт Вескер (Albert Wesker) (Владимир Антоник) — главный злодей пятой части, а по совместительству и всей серии Resident Evil. После крушения Амбреллы, Вескер переметнулся к могущественной корпорации Tricell. Вескер, который давно имеет зуб на весь род людской решает окончательно истребить человечество путем уничтожения самолёта с вирусом на борту. Вескер давно перестал быть человеком. Теперь он — сверхсоздание, обладающее молниеносной реакцией, силой и другими способностями, которые человеку не подвластны. В процессе игры выясняется что именно он убил Озвела Спенсера основателя Амбреллы после того как тот рассказал ему что он был частью эксперимента Спенсера по созданию сверхлюдей в результате которого Спенсер собирался стать богом нового вида людей. Вескер понимая что Спенсер его использовал приходит в ярость и со словами "Право быть богом теперь это мое право…"пробивает тело Спенсера рукой насквозь. В игре довольно часто появляется в роликах. В финале игры улетает на бомбардировщике с целью распылить Уроборос и по его словам стать «Творцом». Но после схватки с Крисом самолет падает в жерло вулкана и начинается финальная битва Криса и Шевы с Вескером в результате которой он падает в лаву и погибает (хотя есть вероятность что он выжил).

* Экселла Жионне (Excella Gionne) — глава Африканского отдела компании Триселл и ассистентка Вескера. Между ними существует скрытая страсть. Использовала свои ресурсы и финансы для создания вируса Уроборос, с помощью которого Вескер собирался фактически подчинить мир себе. Экселла также надеялась на свою долю власти. Но ближе к концу игры Вескер заражает её вирусом Уроборос, и она мутирует. Сам Вескер говорит по этому поводу Крису: «Уроборос не принял её…»

* Джилл Валентайн (Jill Valentine) — один из старейших персонажей серии. После того, как она, спасая жизнь Крису Рэдфилду, выпрыгнула из окна вместе с Альбертом Вескером в особняке Спенсера, все считали, что девушка погибла (хотя тело Джилл не было обнаружено). До середины игры мы ничего не узнаем о её судьбе, лишь потом, под занавес, нам расскажут, что произошло с Джилл на самом деле.

* Личность в капюшоне — персонаж, о котором ничего не известно кроме того, что он помогает Экселле. Ближе к финалу игроку открывается истинная личность этого персонажа.

* Капитан Джош Стоун (Josh Stone) — командир группы Дельта. Учитель Шевы. Отлично разбирается в технике. После гибели своего отряда, выступал в качестве рулевого в лодке. В финальном ролике спасает Криса и Шеву на вертолёте.

* Информатор BSAA Рейнард Фишер (Reynard Fisher) — бывший местный мясник, выдающий в начале игры снаряжение Крису и Шеве. Вскоре погибает — ему отрубает голову палач.

* Эпизод, когда Альберт Вескер срывает с себя очки и кидает их, а после чего вступает в бой с Крисом и Шевой, в одном из роликов игры, присутствует в фильме «Обитель зла 4: Жизнь после смерти»
* Если вы пройдете игру менее, чем за 5 часов, то получите в награду за труды — бесконечную R.P.G..
* Rotten Egg (русск. Тухлое Яйцо) можно продать за 2000$, а если его бросить в противника тот сразу погибает, причем это действует только на обычных Маджини.
* Если вы в начале главы 6-1 заберетесь на самую высокую мачту и убьете со снайперской винтовки Маджини вдалеке, возле рычага, то на Вас и Вашего напарника не упадет клетка и Вам не нужно будет его/ее освобождать.
* В «The Mercenaries» есть самый высокий ранг — SS (в локализованной русской PC версии — «СС»).
* Маджини с R.P.G., Маджини которые мутируют в Цефало или Дуалиа — можно убить одним эффективным способом (но делать это нужно до мутирования): выстрелите в ногу Маджини, чтобы он встал на колено, быстро подойдите сзади и добейте врага кнопкой «Огонь».
* В главе 2-1, в месте, где Вам нужно подсадить Шеву, чтобы та спустилась и открыла Вам запертые ворота (перед первой встречей с Маджини с бензопилой), можно обойтись немного по другому: либо метните гранату так, чтобы она отрекошетила от подвесок противоположного здания и упала недалеко от запертых ворот (замок отлетит от взрывной волны), либо подсадите Шеву (эффективен только при игре с живым напарником) и пусть та метнет гранату (или выстрелит из R.P.G.) в запертые ворота. Около минуты Маджини не будут на Вас нападать, нежели это было в том случае, когда Sheva бежала открывать Вам ворота вручную.
* На протяжение всей игры фигурирует, вирус под названием Уроборос, в одной и частей игры Devil May Cry, а именно во второй, так называлась компания. Разработчиками игры так же является Capcom.